乙型肝炎病毒前基因组RNA探针法荧光定量RT-PCR试剂盒说明书
发表时间：2024-02-20乙型肝炎病毒前基因组RNA探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
Hepatitis B Virus Pregenomic RNA (HBV pgRNA) Probe qRT-PCR Kit
产品及特点；
乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus ，HBV）是一种 RNA 病毒 ， 会引起乙 型病毒性肝炎 ， 是一种以肝脏病变为主的传染病 。临床上以食欲减退、恶心、上 腹部不适、肝区痛、 乏力为主要表现 。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能 损害有些患者可慢性化 ，甚至发展成肝硬化 ， 少数可发展为肝癌 ， 对人体生命健 康造成严重损害 。本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测乙型肝炎病毒前基因组 RNA 的试剂盒 ，它具有下列特点：
1. 即开即用 ， 用户只需要提供样品 RNA 模板。
2. 引物和探针经过优化 ，分析灵敏性高。
3. 提供阳性对照 ， 便于区分假阴性样品。
4. 特异性高 ， 引物是根据乙型肝炎病毒前基因组 RNA 高度保守区设计 ， 不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测 ， 又可用于定量检测 。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分；
运输及保存；
成分
编号
五孔盒包装
探针法 qRT-PCR 缓冲液
190504a
500 μL（白盖）
探针法 qRT-PCR 酶混合液
190504b
100 μL （红盖）
荧光 PCR 专用模板稀释液
180701
1 mL（绿盖）
乙型肝炎病毒前基因组 RNA 探针法 qRT-PCR 引物-探针混合液
15-55900yp
150 μL（棕色管）
乙型肝炎病毒前基因组 RNA 探针法 qRT-PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)
55900pc
50 μL（黄盖）
说明书
15-55900sc
1份
低温运输 ， -20℃保存 ，保存期限为 12 个月。
自备试剂;
样品 RNA ，超纯水。
使用方法;
一、稀释标准曲线样品 （以 10E2- 10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 。
由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分 。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ，本 产品不提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管 ，分别为 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头 ，下同。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震荡 1 分钟 ，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
4. 换枪头 ， 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡 1 分钟 ，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头 ， 在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡 1 分钟 ，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
7. 如果有 N 个样品 ， 最好设置 N+2 个提取 ，多出的是 PC（样品制备阳性对 照） 和 NC（样品制备阴性对照） 。可以取阳性对照的 10000 倍稀释液 10 μL 再加上一定量的水 ，使总体积与待提取样品的规定体积一致 ， 以此作为PC 。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 RNA ，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容 。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout 或免提取核酸释放剂。
三、 probeqRT-PCR反应(20L体系， 在祥品制备室进行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复 ， 则标记 N+9 个 RT-PCR 管 ，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品 ， 1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板）， 6 个用于标准曲线 。如果做定性分析并且只做 1 次重复 ，则标记 N+4 个 RT- PCR 管 ， 其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品 ， 1 个用于 RT-PCR 阴 性对照（用水做模板） ， 1 个用于 RT-PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板） 。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照 ， 并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
后最后加）;
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成分/每管 |
样品管N+2个 |
RT-PCR阴性对照 |
标准曲线样品管(2-7管) |
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探针法 qRT-PCR 缓冲液 |
10 μL |
10 μL |
10 μL |
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探针法 qRT-PCR 酶混合液 |
2 μL |
2 μL |
2 μL |
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乙型肝炎病毒前基因组 RNA 探针法 qRT-PCR 引物-探针混合液 |
3 μL |
3 μL |
3 μL |
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N+2 个待测 RNA 样本 |
5 μL |
不加 |
不加 |
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自备超纯水 |
不加 |
5 μL |
不加 |
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第 6 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） |
不加 |
不加 |
5μL（ 2 号样到 2 号管 ，3 号样 到 3 号管 …） |
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过程 |
温度 |
时间 |
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逆转录 |
50℃ |
20 min |
|
预变性 |
94℃ |
5 min |
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RT-PCR 反应 （45 个循环） |
94℃ |
20 sec |
|
62℃ |
20 sec （采集 FAM 通道的荧光信号） |
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72℃ |
40 sec |
12. 如果把本试剂盒用于定量检测 ，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴 ， 以 Ct 值 为纵轴 ，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log 值 ， 再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测 ， 只判断阳性或阴性 ，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40 。阳性对照必须有荧光对数增长 ， 有典型扩增曲线 ，Ct 值应该 小于或等于 38 。对待测样品 ，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性 ，如果小 于或等于 38 则为阳性 。如果在 38-40 之间 ， 则重复一次 。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性 ， 如果小于 40 ，则为阳性。
