DPPH 自由基清除能力试剂盒说明书

DPPH 自由基清除能力试剂盒说明书

(50 管/48 样) 

此法是根据 DPPH 自由基有单电子，在 517nm 处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，即 A 值越低，进而对样本中 DPPH 清除能力进行定量分析。

二、试剂组成与配置：

试剂名称	规格	保存	备注
试剂一	工作液粉剂×1 瓶	4℃避光	临用前甩几下使试剂落入底部，再加入 40mL无水乙醇充分溶解后备用；用不完的试剂 4℃避光保存
试剂二	标准品粉剂×1 支	4℃	制作标准曲线用

三、所需仪器和用品：
可见光分光光度计、1mL 比色皿（光径 1cm）、离心机、移液器、无水甲醇、无水乙醇、蒸馏水。
四、实验步骤：
操作前请仔细阅读第六点《注意事项》,了解相关注意点。
1、样本前处理：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，剪碎，加入 1mL 的 80%甲醇溶液（或按样本重量 g：80%甲醇溶液体积 mL 为1:10 或 1:5 的比例加），冰水浴匀浆，12000 转/分钟，离心 10 分钟，取上清置冰上待测。
② 液体样本：直接检测，若浑浊，离心后取上清测定。
2、操作步骤：（EP 管中操作）

	对照管	测定管	空白管
样本（μL）	400	400
80%甲醇（μL）	600		400
工作液（μL）		600	600
混匀，室温 25℃避光静置 30min，4000 转/分钟离心 5 分钟，波长 517nm，吸取 800μL 至比色皿中，无水乙醇调零，测定各管吸光度值。

（注：做预试时若 A 测定－A 对照接近或小于 0.05，则需对样本进行稀释后再检测，稀释倍数代入公式计算；若样本较多，建议分批次测定；空白管只需做 1-2 个）
五、结果计算：
1、标准曲线制作：
（将标准品粉剂一支加无水甲醇 2mL 溶解，即为 0.5mg/mL（Trolox）标准应用液，再用无水甲醇分别稀释成 5μg /mL、10μg/mL、15μg /mL、20μg /mL、25μg /mL 参照下表代入操作）

标准品浓度(μg /mL)	0	5	10	15	20	25
标准液（μL）	400	400	400	400	400	400
工作液（μL）	600	600	600	600	600	600
混匀，室温 25℃避光静置 30min，波长 517nm，1cm 光径，无水乙醇调零，测定各管吸光度

2、DPPH 自由基清除率（%）=(1-(A 测定－A 对照)÷A 空白)×100%
3、定义：用从标准曲线算得的相当于抗氧化剂 Trolox 的量来表示样本的 DPPH 自由基清除能力。
4、计算公式：

六、注意事项：
1、样本测试前一定要进行预试，一方面了解本批样品情况（或所需稀释倍数），否则如果清除率太大（≥90），计算结果偏低；另一方面也可熟悉实验流程，避免样本与试剂的浪费；
2、标准曲线也可根据需要来调整标准浓度，上限不大于 25μg/mL；
3、因乙醇易挥发，所以不建议用酶标仪来读数；
4、操作时应在一个通风条件良好的环境中进行，以免吸入过量甲醇中毒；
5、本试剂盒仅用于科研。